国家生物医学实验细胞资源库近日发布，成功建立了100多个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株，其中包括肝癌、胆管癌细胞系。这些细胞系经过转染、筛选、鉴定，得到了稳定表达cas9且有活性的衍生细胞系，携带荧光标记。可以方便用于细胞相互作用、信号通路上下游分子相互调节、基因功能研究。这一成果将有助于更好地理解肝癌、胆管癌的发病机制，为肝癌、胆管癌的治疗提供新的思路。不仅有助于生物医学相关领域对新药、新疗法、抗击新冠等的研发简化量化研究周期和流程，提高效率，降低我国相关研究的准入门槛，盘活既有科技资源，也可为生物医药核心尖端产业发展提供专利及技术保障支持。

CRISPR/Cas9系统是国际主流尖端的基因编辑技术；对生物医药发展有重要变革意义；国家生物医学实验细胞资源库建立Cas9蛋白稳定表达的人肝胆癌细胞株,并验证Cas9的基因编辑活性,以便利用CRISPR/Cas9系统开展肝胆细胞基因编辑的研究.方法 在人肝癌细胞(Huh7、PLC/PRF/5、HepG2、Hep3b、SK-HEP-1和Li-7)、人胆管癌细胞(RBE)和人胆囊癌细胞(GBC-SD)中,分别感染Cas9表达质粒pLv-EF1α-Cas9-Flag-Neo、pLv-EF1α-Cas9-Flag-Puro和Cas9m1.1,挑选单细胞克隆培养扩增.提取基因组DNA和总蛋白后,通过基因组聚合酶链反应(PCR)和Western blot验证Cas9的稳定表达.选取其中3个细胞株并感染Lv-EF1α-mCherry,流式细胞术分选出mCherry阳性的细胞,再通过慢病毒感染靶向mCherry基因的向导RNA,细胞扩增后,通过基因组PCR、荧光显微镜下观察和流式细胞术检测mCherry被敲除的情况.结果 筛选到100个Cas9稳定表达的人肝胆癌细胞株,其中表达Cas9-Neo的细胞35株,表达Cas9-Puro的细胞25株,表达突变型Cas9的细胞40株.建立了3株mCherry稳定表达的细胞系Huh7-mCas9-M、PLC/PRF/5-Cas9-M和SK-HEP-1-Cas9-M.基因组PCR和测序显示,同时感染2种gRNA的细胞基因组内存在mCherry片段缺失.荧光显微镜下,同时感染2种gRNA的细胞可以观察到mCherry-EGFP+细胞.流式细胞仪检测结果显示,mCherry-EGFP+细胞占0.3％～93.6％. 。

此大类别尖端工程细胞的建立是国家生物医学实验细胞资源库在国家科技基础条件平台中心指导下，发挥主观能动性，极具创新性的优化资源结构，秉承国家库多做一点，我国科学研究就轻松便捷一点的宗旨。为我国科学事业发展和共享工程做出的又一贡献。

文章：Establishment of Cas9 stably expressed human hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma cell lines

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